Untersuchungen zur induzierbaren Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin und dessen potentieller Bedeutung bei der Tumormetastasierung

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die durch TNFalpha-, als auch durch Röntgenstrahlen vermittelte Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin in Endothelzellen durch kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie reguliert ist. Hemmung dieser kleinen G-Proteine z.B. durch HMG-CoA Reduktase-Inhibitoren (Statine) oder clostridiale Toxine führt zu verminderter Expression von E-Selektin in humanen Endothelzellen (HUVEC; EA.hy-926). Aus den in der Arbeit erhaltenen Ergebnissen kann außerdem die Schlussfolgerung gezogen werden, dass die Regulation der zytokininduzierten E-Selektin-Genexpression von der gamma-Strahlen-vermittelten Expression des E-Selektingens differiert. Für die strahleninduzierte endotheliale E-Selektin-Expression scheint beispielsweise der Transkriptionsfaktor AP-1 als ein weiterer Kontrollfaktor neben NF-kappaB zu fungieren. Des Weiteren konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass eine gesteigerte E-Selektin-Proteinexpression mit erhöhter Tumorzelladhäsion und -transmigration an bzw. durch humane Endothelzellen korreliert. Hemmung der TNFalpha- bzw. gamma-Strahlen-induzierten Expression von E-Selektin durch Statine oder Retinsäuren ist ausreichend, sowohl Tumorzelladhäsion als auch Tumorzelldiapedese zu reduzieren. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass das Adhäsionsmolekül E-Selektin eine vielversprechende Zielstruktur ist, über deren kontrollierte Beeinflussung es auch in vivo möglich sein sollte, das Risiko der Metastasierung zu reduzieren. Mit Statinen und Retinsäurederivaten wurden somit Pharmaka identifiziert, die durch Hemmung der Rho-regulierten E-Selektin-Expression der Tumorzellmetastasierung vorbeugen könnten. Um diese Hypothese in zukünftigen tierexperimentelle Studien zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit mit der Generierung transgener Tiermodelle begonnen.

Molekulare Mechanismen der Knochenmetastasierung des Nierenzellkarzinoms

Die schlechte Prognose des Nierenzellkarzinoms (NZK) kommt nicht durch den Primärtumor an sich zustande, sondern durch das Vorhandensein von Fernmetastasen. Obwohl bereits vieles über die Mechanismen der Metastasierung bekannt ist, sind die Hintergründe der Organspezifität metastasierender Tumorzellen weitgehend ungeklärt. In 30% der Fälle kommt es zur Entstehung von Knochenmetastasen. Diese hohe Frequenz deutet darauf hin, dass NZK-Zellen bevorzugt in dieses Organ metastasieren, da die Knochenmatrix ein günstiges Mikromilieu für ihr Wachstum bietet. Hierbei könnte extrazellulärem Calcium und dem für die Detektion zuständigen Calcium-sensitiven Rezeptor (CaSR) eine entscheidende Rolle zukommen, da sich Knochen durch ihren hohen Gehalt an Calcium auszeichnen und von anderen Organen unterscheiden. Das Ziel der vorliegenden Dissertation lag in der Aufklärung der Mechanismen, die zu einer Knochenmetastasierung des NZK führen.rnrnIn ersten Analysen konnte gezeigt werden, dass sich bereits der Primärtumor durch eine von Calcium unabhängige charakteristische Expression bestimmter Signalmediatoren auszeichnet, die Metastasierungspotenzial und –ort bestimmen. So wurden in Gewebeproben und primären Tumorzellen von NZK-Patienten, die innerhalb von fünf Jahren nach Nephrektomie Knochenmetastasen entwickelten, in Westernblot-Analysen eine sehr hohe Expression der α5-Integrine, eine starke Aktivität von Akt, FAK und eine Reduktion der PTEN-Expression detektiert. Diese Veränderungen begünstigten die chemotaktische Migration in Richtung Fibronektin (bestimmt in einer Boyden-Kammer) und die Adhäsion dieser NZK-Zellen an Komponenten der Extrazellularmatrix (Fibronektin und Kollagen I – beides ist Bestandteil der Knochenmatrix). Migration und Adhäsion sind essentielle Schritte beim Austreten der Tumorzellen aus dem Primärtumor und Infiltration des Knochens. In NZK-Zellen von Patienten, die keine Metastasen oder Lungenmetastasen entwickelten, waren diese Charakteristika nicht oder deutlich schwächer ausgeprägt. Bestimmte Primärtumore sind somit prädestiniert Knochenmetastasen auszubilden.rnrnUm die Bedeutung von extrazellulärem Calcium und dem CaSR darzustellen, wurde die Expression des CaSR mittels Real-Time PCR, Westernblot-Analysen und durchflusszytometrisch in NZK-Gewebeproben und –Zellen von Patienten untersucht, die innerhalb von fünf Jahren nach Nephrektomie keine bzw. Lungen- oder Knochenmetastasen ausbildeten. Proben von Patienten mit Knochenmetastasen zeigten die stärkste Expression von CaSR-mRNA und CaSR-Protein. Durch eine Behandlung der NZK-Zellen mit Calcium in physiologischen Konzentrationen, konnte Calcium als möglicher Regulator der CaSR-Expression ausgeschlossen werden. Der Einfluss von Calcium auf die Metastasierungsfähigkeit der primären NZK-Zellen wurde anhand eines weiteren chemotaktischen Migrationsversuchs mit Calcium als Chemotaxin analysiert. Die Zellproliferationsrate konnte nach Behandlung der Zellen mit Calcium mittels BrdU-Inkorporation gemessen werden. NZK-Zellen, die aus dem Primärtumor von Patienten mit Knochenmetastasen kultiviert wurden, konnten durch eine erhöhte extrazelluläre Calcium-Konzentration verstärkt zu Migration und Proliferation (Konzentrations-abhängige Steigerung) angeregt werden. Diese stellen weitere essentielle Schritte bei der Infiltration und Vermehrung der NZK-Zellen in den Knochen dar. Die Effekte traten bei NZK-Zellen aus Patienten, die keine oder Lungenmetastasen ausbildeten, nicht auf. Die Identifizierung der beteiligten Signalwege erfolgte in Westernblot-Analysen und einem Phospho-Kinase Array. Hierdurch konnten eine verstärkte Aktivierung des Akt-, JNK-, p38α- und PLCγ-1-Signalwegs und eine beinahe vollständige Reduktion der PTEN-Expression nach Calcium-Behandlung in Knochen-metastasierenden NZK-Zellen aufgedeckt werden. Durch Blockierung des CaSR mittels des Inhibitors NPS 2143 konnte bestätigt werden, dass die metastasierungs-fördernde Wirkung von Calcium über den CaSR zustande kommt. rnrnNZK-Zellen zeichnen sich somit bereits im Primärtumor durch eine charakteristische Expression verschiedener Signalmediatoren aus, die ihr Metastasierungspotenzial und die mögliche Lokalisation der Metastase bestimmen. Gelangen metastasierende NZK-Zellen auf ihrem Weg durch den Blutkreislauf in das Knochenmilieu, verhilft ihnen hier eine hohe Expression des CaSR zu einem wichtigen Überlebensvorteil. Extrazelluläres Calcium wirkt über den CaSR, verstärkt ihre metastatischen Eigenschaften und fördert schließlich die Ausbildung einer Knochenmetastase. Aus diesem Grund kommt dem CaSR eine Rolle als möglicher prognostischer Marker hinsichtlich der Knochenmetastasierung beim NZK zu. Die Charakteristika des Primärtumors sollten daher die Auswahl des adjuvanten Therapeutikums und die Nachsorgeuntersuchungen beeinflussen. um die Medizin dem Ziel einer individualisierten Therapie näher zu bringen.rn

Molekulare Ursachen und therapeutische Intervention bei der Alzheimer-Demenz

Ein charakteristisches, neuropathologisches Merkmal der Alzheimer-Demenz (AD), der am häufigsten vorkommenden Demenz-Form des Menschen, ist das Auftreten von senilen Plaques im Gehirn der Patienten. Hierbei stellt das neurotoxische A-beta Peptid den Hauptbestandteil dieser Ablagerungen dar. Einen Beitrag zu der pathologisch erhöhten A-beta Generierung liefert das verschobene Expressionsgleichgewicht der um APP-konkurrierenden Proteasen BACE-1 und ADAM10 zu Gunsten der beta-Sekretase BACE-1. In der vorliegenden Dissertation sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zu einem pathologisch veränderten Gleichgewicht der APP-Spaltung und somit zum Entstehen und Fortschritt der AD beitragen. Des Weiteren sollten Substanzen identifiziert werden, die durch Beeinflussung der Genexpression einer der beiden Proteasen das physiologische Gleichgewicht der APP-Prozessierung wiederherstellen können und somit therapeutisch einsetzbar sind.rnAnhand eines „Screenings“ von 704 Transkriptionsfaktoren wurden 23 Faktoren erhalten die das Verhältnis ADAM10- pro BACE-1-Promotor Aktivität beeinflussten. Exemplarisch wurden zwei der molekularen Faktoren auf ihren Wirkmechanismus untersucht: Der TF „X box binding protein-1“ (XBP-1), der die so genannte „unfolded protein response“ (UPR) reguliert, erhöhte die Expression von ADAM10 in Zellkultur-Experimenten. Die Menge dieses Faktors war in AD-Patienten im Vergleich zu gesunden, Alters-korrelierten Kontrollen signifikant erniedrigt. Im Gegensatz dazu verminderte der Seneszenz-assoziierte TF „T box 2“ (Tbx2) die Menge an ADAM10 in SH-SY5Y Zellen. Die Expression des Faktors selbst war in post-mortem Kortexgewebe von AD-Patienten erhöht. Zusätzlich zu den TFs konnten in einer Kooperation mit dem Helmholtz Zentrum München drei microRNAs (miRNA 103, 107, 1306) bioinformatisch prädiziert und experimentell validiert werden, die die Expression des humanen ADAM10 reduzierten.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten damit körpereigene Faktoren identifiziert werden, die die Menge an ADAM10 regulieren und folglich potenziell an der Entstehung der gestörten Homöostase der APP-Prozessierung beteiligt sind. Somit ist die AD auch im Hinblick auf eine A-beta-vermittelte Pathologie als multifaktorielle Krankheit zu verstehen, in der verschiedene Regulatoren zur gestörten APP-Prozessierung und somit zur pathologisch gesteigerten A-beta Generierung beitragen können. rnEine pharmakologische Erhöhung der ADAM10 Genexpression würde zu der Freisetzung von neuroprotektivem APPs-alpha und gleichzeitig zu einer reduzierten A-beta Generierung führen. Deshalb war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Evaluierung von Substanzen mit therapeutischem Potenzial im Hinblick auf eine erhöhte ADAM10 Expression. Von 640 FDA-zugelassenen Medikamenten einer Substanz-Bibliothek wurden 23 Substanzen identifiziert, die die Menge an ADAM10 signifikant steigerten während die Expression von BACE-1 und APP unbeeinflusst blieb. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie (Johannes Gutenberg Universität Mainz) wurde ein Zellkultur-basiertes Modell etabliert, um die Permeationsfähigkeit der potenziellen Kandidaten-Substanzen über die Blut-Hirn Schranke (BHS) zu untersuchen. Von den 23 Medikamenten konnten neun im Rahmen des etablierten Modells als BHS-gängig charakterisiert werden. Somit erfüllen diese verbleibenden Medikamente die grundlegenden Anforderungen an ein AD-Therapeutikum. rnADAM10 spaltet neben APP eine Vielzahl anderer Substrate mit unterschiedlichen Funktionen in der Zelle. Zum Beispiel reguliert das Zelladhäsionsmolekül Neuroligin-1 (NL-1), das von ADAM10 prozessiert wird, die synaptische Funktion exzitatorischer Neurone. Aus diesem Grund ist die Abschätzung potenzieller, Therapie-bedingter Nebenwirkungen sehr wichtig. Im Rahmen eines Forschungsaufenthalts an der Universität von Tokio konnte in primären, kortikalen Neuronen der Ratte bei einer Retinoid-induzierten Erhöhung von ADAM10 neben einer vermehrten alpha-sekretorischen APP-Prozessierung auch eine gesteigerte Spaltung von NL-1 beobachtet werden. Dies lässt vermuten, dass bei einer Behandlung mit dem Retinoid Acitretin neben einer vermehrten APP-Spaltung durch ADAM10 auch die Regulation glutamaterger Neurone durch die Spaltung von NL-1 betroffen ist. Anhand eines geeigneten Alzheimer-Tiermodells sollten diese Befunde weiter analysiert werden, um so auf einen sicheren therapeutischen Ansatz bezüglich einer vermehrten ADAM10 Genexpression schließen zu können.rn

Expanding the scope of poly(ethylene glycol)s for bioconjugation to squaric acid-mediated PEGylation and pH-sensitivity

Poly(ethylene glycol) (PEG) is used in a broad range of applications due to its unique combination of properties and is approved use in formulations for body-care products, edibles and medicine. This thesis aims at the synthesis and characterization of novel heterofunctional PEG structures and the establishment of diethyl squarate as a suitable linker for the covalent attachment to proteins. Chapter 1 is an introduction on the properties and applications of PEG as well as the fascinating chemistry of squaric acid derivatives. In Chapter 1.1, the synthesis and properties of PEG are described, and the versatile applications of PEG derivatives in everyday products are emphasized with a focus on PEG-based pharmaceuticals and nonionic surfactants. This chapter is written in German, as it was published in the German Journal Chemie in unserer Zeit. Chapter 1.2 deals with PEGs major drawbacks, its non-biodegradability, which impedes parenteral administration of PEG conjugates with polyethers exceeding the renal excretion limit, although these would improve blood circulation times and passive tumor targeting. This section gives a comprehensive overview of the cleavable groups that have been implemented in the polyether backbone to tackle this issue as well as the synthetic strategies employed to accomplish this task. Chapter 1.3 briefly summarizes the chemical properties of alkyl squarates and the advantages in protein conjugation chemistry that can be taken from its use as a coupling agent. In Chapter 2, the application of diethyl squarate as a coupling agent in the PEGylation of proteins is illustrated. Chapter 2.1 describes the straightforward synthesis and characterization of squaric acid ethyl ester amido PEGs with terminal hydroxyl functions or methoxy groups. The reactivity and selectivity of theses activated PEGs are explored in kinetic studies on the reactions with different lysine and other amino acid derivatives, followed by 1H NMR spectroscopy. Further, the efficient attachment of the novel PEGs to a model protein, i.e., bovine serum albumin (BSA), demonstrates the usefulness of the new linker for the PEGylation with heterofunctional PEGs. In Chapter 2.3 initial studies on the biocompatibility of polyether/BSA conjugates synthesized by the squaric acid mediated PEGylation are presented. No cytotoxic effects on human umbilical vein endothelial cells exposed to various concentrations of the conjugates were observed in a WST-1 assay. A cell adhesion molecule - enzyme immunosorbent assay did not reveal the expression of E-selectin or ICAM-1, cell adhesion molecules involved in inflammation processes. The focus of Chapter 3 lies on the syntheses of novel heterofunctional PEG structures which are suitable candidates for the squaric acid mediated PEGylation and exhibit superior features compared to established PEGs applied in bioconjugation. Chapter 3.1 describes the synthetic route to well-defined, linear heterobifunctional PEGs carrying a single acid-sensitive moiety either at the initiation site or at a tunable position in the polyether backbone. A universal concept for the implementation of acetal moieties into initiators for the anionic ring-opening polymerization (AROP) of epoxides is presented and proven to grant access to the degradable PEG structures aimed at. The hydrolysis of the heterofunctional PEG with the acetal moiety at the initiating site is followed by 1H NMR spectroscopy in deuterium oxide at different pH. In an exploratory study, the same polymer is attached to BSA via the squarate acid coupling and subsequently cleaved from the conjugate under acidic conditions. Furthermore, the concept for the generation of acetal-modified AROP initiators is demonstrated to be suitable for cholesterol, and the respective amphiphilic cholesteryl-PEG is cleaved at lowered pH. In Chapter 3.2, the straightforward synthesis of α-amino ω2-dihydroxyl star-shaped three-arm PEGs is described. To assure a symmetric length of the hydroxyl-terminated PEG arms, a novel AROP initiator is presented, who’s primary and secondary hydroxyl groups are separated by an acetal moiety. Upon polymerization of ethylene oxide for these functionalities and subsequent cleavage of the acid-labile unit no difference in the degree of polymerization is seen for both polyether fragments.

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien rnDas humane Usher Syndrom (USH) ist die häufigste Form vererbter Taub-Blindheit. In der vorliegenden Dissertation wurde diese komplexe Erkrankung auf verschiedenen Ebenen analysiert: in Arbeiten zur Expression und Lokalisation von USH-Proteinen, der Analyse der USH-Proteinnetzwerke und deren Funktionen sowie darauf aufbauend die Entwicklung von Therapiestrategien für USH.rnIm Rahmen der Arbeit wurde die Expression und (sub)-zelluläre Lokalisation des USH1D-Genproduktes CDH23 in der Retina und Cochlea analysiert. CDH23-Isoformen werden in der Maus zeitlich und räumlich differentiell exprimiert. In den Retinae von Mäusen, nicht humanen Primaten und Menschen zeigten Analysen eine unterschiedliche Expression und Lokalisation des Zell-Zelladhäsionsmoleküls CDH23, was auf Funktions-unterschiede der einzelnen Isoformen in den analysierten Spezies hindeutet.rnAnalysen zur Aufklärung der USH-Proteinnetzwerke ergaben eine potentielle Interaktion des USH1G-Gerüstproteins SANS mit dem Golgi- und Centrosom-assoziierten Protein Myomegalin. Die direkte Interaktion der Proteine konnte durch unabhängige Experimente verifiziert werden. Beide Interaktionspartner sind in den Retinae verschiedener Spezies partiell ko-lokalisiert und partizipieren im periciliären USH-Proteinnetzwerk. Die Assoziation von SANS und Myomegalin mit dem Mikrotubuli-Cytoskelett weist auf eine Funktion des Proteinkomplexes in gerichteten Transportprozessen innerhalb der Photorezeptoren hin und bekräftigt die Hypothese einer Rolle von SANS und assoziierten Netzwerken mit Transportprozessen.rnDas hier gewonnene erweiterte Verständnis der molekularen Grundlagen sowie die Aufklärung der zellulären Funktion der Proteinnetzwerke ermöglichen die Entwicklung therapeutischer Strategien für USH. Ein Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der Entwicklung genbasierter Therapiestrategien und deren Evaluation, wobei der Schwerpunkt auf der Therapiestrategie der Genreparatur lag. Die mit Hilfe von Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) induzierte Homologe Rekombination für die Genkorrektur wurde exemplarisch an der 91C>T/p.R31X-Mutation im USH1C-Gen gezeigt. Effiziente ZFN wurden identifiziert, generiert und erfolgreich im Zellkulturmodellsystem eingesetzt. Die Analysen demonstrierten eine Reparatur der Mutation durch Homologe Rekombination auf genomischer Ebene und die Expression des wiederhergestellten Proteins. Durch die Genkorrektur im endogenen Lokus sind Größe des Gens, Isoformen oder die Art der Mutation keine limitierenden Faktoren für die Therapie. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente unterstreichen das enorme Potential ZFN-basierter Therapiestrategien hin zu personalisierten Therapieformen nicht nur für USH sondern auch für andere erbliche Erkrankungen, deren genetische Grundlagen bekannt sind.rn

Die Rolle der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen im Zentralen Nervensystem

Im Fokus dieser Studie stehen die zu den Gliazellen zählenden OPC, sowie das von diesen exprimierte Typ-1 Membranprotein NG2. Dieses wird auf eine Prozessierung durch α- und γ-Sekretase, in Analogie zu Proteinen wie Notch oder APP, untersucht.rnEine solche Prozessierung ginge mit zusätzlichen intrazellulären Spaltprodukten neben der bekannten Ektodomäne einher. Da OPC mit dem Neuronalen Netzwerk durch synaptische Innervierungen in Verbindung stehen, stellt sich die Frage, ob diese mit der Spaltung von NG2 in Verbindung gebracht werden können. Dazu käme mechanistisch beispielsweise eine aktivitätsabhängige Regulierung der Proteolyse, wie sie jüngst für das neuronale synaptische cell adhesion molecule Neuroligin gezeigt werden konnte, in Frage. Zudem werden eine physiologische Rolle der NG2 Ektodomäne bzw. der möglichen intrazellulären Fragmente untersuchen. Insbesondere potentielle neuromodulatorische Funktionen sind hier von Interesse, da diese die OPC tiefer in das Neuronale Netzwerk integrieren würden. Die Existenz eines NG2 Homologes in D. melanogaster, wirft weiterhin die Frage auf, in wie weit diese Mechanismen in diesem Modellsystem konserviert sind.rnIn Analogie zur Lokalisierung von Markerproteinen an Neuron-Neuron Synapsen in vivo, ergibt sich die Frage ob sich die synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen und OPC in ähnlicher Weise darstellen lassen.rnEin Charakteristikum von OPC ist die Teilungsaktivität in sich entwickelnden und adulten Säugern. Zudem gibt es Evidenzen für direkte funktionelle Verknüpfungen zwischen dem NG2 Protein und dem Teilungsmodus der OPC. Deshalb war ein weiteres Ziel mögliche Änderungen in der Zellteilung der OPC, die mit dem NG2 Protein in Verbindung stehen könnten, in NG2 -/- Mäusen zu untersuchen.rn

The central role of Fyn kinase in axon-glial signalling and translation of myelin proteins

During central nervous system myelination, oligodendrocytes extend membrane processes towards an axonal contact site which is followed by ensheathment resulting in a compacted multilamellar myelin sheath. The formation of this axon-glial unit facilitates rapid saltatory propagation of action potentials along the axon and requires the synthesis and transport of copious amounts of lipids and proteins to the axon-glial contact site. Fyn is a member of the Src family of non receptor tyrosine kinases and inserted into the inner leaflet of the oligodendrocyte membrane by acylation. Fyn activity plays a pivotal role in the maturation of oligodendrocytes and the myelination process. It was suggested previously that Fyn kinase can be stimulated by binding of a neuronal ligand to oligodendroglial F3/ contactin, a glycosyl-phosphatidyl-inositol anchored immunoglobulin superfamily (IgSF) member protein. It could be shown here, that neuronal cell adhesion molecule L1 binds to oligodendrocytes in an F3-dependent manner and activates glial Fyn. In the search for downstream participants of this novel axon-glial signalling cascade, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A2 was identified as a novel Fyn target in oligodendrocytes. HnRNP A2 was known to be involved in the localisation of translationally repressed myelin basic protein (MBP) mRNA by binding to a cis acting A2 response element (A2RE) present in the 3’ untranslated region. Transport of MBP mRNAs occurs in RNA-protein complexes termed RNA granules and translational repression during transport is achieved by hnRNP A2-mediated recruitment of hnRNP E1 to the granules. It could be shown here, that Fyn activity leads to enhanced translation of reporter mRNA containing a part of the 3’ UTR of MBP including the A2RE. Furthermore hnRNP E1 seems to dissociate from RNA granules in response to Fyn activity and L1 binding. These findings suggest a novel form of neuron- glial communication: Axonal L1 binding to oligodendroglial F3 activates Fyn kinase. Activated Fyn phosphorylates hnRNP A2 leading to removal of hnRNP E1 from RNA granules initiating the translation of MBP mRNA. MBP is the second most abundant myelin protein and mice lacking this protein show a severe hypomyelination phenotype. Moreover, the brains of Fyn knock out mice contain reduced MBP levels and are hypomyelinated. Hence, L1-mediated MBP synthesis via Fyn as a central molecule could be part of a regulatory mechanism required for myelinogenesis in the central nervous system.

Fyn kinase targets in oligodendroglial physiology and myelination

In the central nervous system (CNS), oligodendrocytes form the multilamellar and compacted myelin sheath by spirally wrapping around defined axons with their specialised plasma membrane. Myelin is crucial for the rapid saltatory conduction of nerve impulses and for the preservation of axonal integrity. The absence of the major myelin component Myelin Basic Protein (MBP) results in an almost complete failure to form compact myelin in the CNS. The mRNA of MBP is sorted to cytoplasmic RNA granules and transported to the distal processes of oligodendrocytes in a translationally silent state. A main mediator of MBP mRNA localisation is the trans-acting factor heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A2 which binds to the cis-acting A2 response element (A2RE) in the 3’UTR of MBP mRNA. A signalling cascade had been identified that triggers local translation of MBP at the axon-glial contact site, involving the neuronal cell adhesion molecule (CAM) L1, the oligodendroglial plasma membrane-tethered Fyn kinase and Fyn-dependent phosphorylation of hnRNP A2. This model was confirmed here, showing that L1 stimulates Fyn-dependent phosphorylation of hnRNP A2 and a remodelling of A2-dependent RNA granule structures. Furthermore, the RNA helicase DDX5 was confirmed here acting together with hnRNP A2 in cytoplasmic RNA granules and is possibly involved in MBP mRNA granule dynamics.rnLack of non-receptor tyrosine kinase Fyn activity leads to reduced levels of MBP and hypomyelination in the forebrain. The multiadaptor protein p130Cas and the RNA-binding protein hnRNP F were verified here as additional targets of Fyn in oligodendrocytes. The findings point at roles of p130Cas in the regulation of Fyn-dependent process outgrowth and signalling cascades ensuring cell survival. HnRNP F was identified here as a novel constituent of oligodendroglial cytoplasmic RNA granules containing hnRNP A2 and MBP mRNA. Moreover, it was found that hnRNP F plays a role in the post-transcriptional regulation of MBP mRNA and that defined levels of hnRNP F are required to facilitate efficient synthesis of MBP. HnRNP F appears to be directly phosphorylated by Fyn kinase what presumably contributes to the initiation of translation of MBP mRNA at the plasma membrane.rnFyn kinase signalling thus affects many aspects of oligodendroglial physiology contributing to myelination. Post-transcriptional control of the synthesis of the essential myelin protein MBP by Fyn targets is particularly important. Deregulation of these Fyn-dependent pathways could thus negatively influence disorders involving the white matter of the nervous system.rnrn

Mechanistic study of the effects of 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) on reporter gene expression in mammalian cells

DNA damage causes replication errors, leading to genetic instability or cell death. Besides that, many types of DNA base modifications have been shown to interfere with transcriptional elongation if they are located in the transcribed DNA strand of active genes, acting as roadblocks for RNA polymerases. It is widely assumed that transcription blockage by endogenous DNA damage is responsible for the early cell senescence in organs and accelerated ageing observed in individuals with compromised nucleotide excision repair.rnThe aims of this work were to design new experimental systems for testing transcription blocking potentials of DNA base modifications in an individual gene and to apply these test systems to the investigation of the effects of a frequent endogenously generated base modification, namely 8-oxo-7,8-hydroxyguanine (8-oxoG), on the gene transcription in cells. Several experimental strategies were employed for this purpose. First, I constructed an episomal vector encoding for a short-lived EGFP-ODC fusion protein and measured expression of the reporter gene in permanently transfected clonal cell lines exposed to DNA damaging agents. Second, the expression of plasmid-borne EGFP gene damaged with photosensitisers to obtain one or several oxidative purine modifications per plasmid molecule was determined in transiently transfected human and mouse host cells in an approach known as “host cell reactivation”. As a prerequisite for these experiments, a robust method of precise quantitative measurement of the EGFP gene expression in transiently transfected cells by flow cytometry was developed and validated. Third, I elaborated a very efficient procedure for insertion of synthetic oligonucleotides carrying 8-oxoG into plasmid DNA, avoiding any unwanted base damage and strand breaks. The consequences of 8-oxoG placed in defined positions in opposing DNA strands of the EGFP gene for transcription were measured by host cell reactivation in cells with functional 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) gene and in OGG1 null cells.rnThe results obtained in Ogg1-/- cells demonstrated that unrepaired 8-oxoG, even if situated in the transcribed DNA strand, does not have any negative effect on the reporter gene transcription. On the other hand, as few as one 8-oxoG was sufficient to cause a significant decrease of the gene expression in OGG1-proficient cell lines, i.e. in the presence of base excision repair. For two analysed positions of 8-oxoG in the plasmid DNA, the inhibition of gene transcription by the base modification correlated with the efficiency of its excision by purified OGG1 protein under cell-free conditions. Based on these findings, it has to be concluded that the observed decrease of transcription is mediated by excision of the base modification by OGG1 and probably caused by the repair-induced single-strand breaks. The mechanism of transcription inhibition by 8-oxoG is therefore clearly distinct from stalling of elongating RNA polymerase II complexes at the modified base.

Pharmakologische Hemmung strahleninduzierter Tumorzell-Endothelzell-Interaktionen in vitro und Metastasierungsprozesse in vivo

Exposition von Endothelzellen mit ionisierender Strahlung (IR) oder Behandlung mit inflammatorischen Zytokinen (z. B. TNFa) induziert über eine Rho-GTPasen abhängige NF-kB-Aktivierung die Expression verschiedener Zelladhäsionsmoleküle, u. a. auch von E-Selektin. E-Selektin vermittelt die Adhäsion von Tumorzellen (TC) an Endothelzellen und ist daher vermutlich an der Extravasation von zirkulierenden Tumorzellen beteiligt. HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Statine), welche eine breite klinische Anwendung als Lipidsenker erfahren, sind in der Lage, Rho-GTPasen und die durch sie vermittelten Signalwege zu hemmen. Daher sollten Statine wie Lovastatin auch Zell-Zell-Adhäsionsvorgänge beeinflussen. Die vorliegende Arbeit widmet sich den Mechanismen, mit denen IR und TNF in Endothel- und/oder Tumorzellen pro-adhäsive Faktoren induzieren können und ob diese Effekte durch Lovastatin beeinflussbar sind. Zu diesem Zweck wurde mittels eines ELISA-basierenden Zelladhäsions-Assays die Auswirkung von IR und TNF auf Zell-Zell-Kontakte zwischen humanen Tumorzellen (u. a. Kolonkarzinomzellen (HT29)) und humanen, venösen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) analysiert. Zudem wurden die Effekte einer Lovastatinvorbehandlung von TC und/oder HUVEC auf TC-HUVEC-Adhäsion untersucht. Des Weiteren wurden die Wirkungen des sLex-Mimetikums Glycyrrhizin und des Rac1-spezifischen „small-molecule“ Inhibitors NSC23766 auf TC-HUVEC-Adhäsion überprüft. Zusätzlich wurde die strahleninduzierbare mRNA-Expression von diversen Zelladhäsionsmolekülen, Metastasierungsfaktoren und DNA-Reparatur-Genen mittels qRT-PCR (Real-Time Analysen) quantitativ erfasst. Um die erhaltenen in vitro Ergebnisse auch in vivo zu bestätigen, untersuchten wir den Effekt einer Ganzkörperbestrahlung (TBI) von BALB/c-Mäusen auf die Expression von pro-adhäsiven Faktoren. Zur Analyse der Tumorzell-Extravasation wurden Tumorzellen in die laterale Schwanzvene immundefizienter Mäuse injiziert und anschließend eine Ganzkörperbestrahlung durchgeführt (4 Gy). Nach einer Wartezeit von 4 Wochen wurde ein erhöhtes Auftreten von Lungenmetastasen beobachtet, welches durch Vorbehandlung der Tiere mit Statinen, NSC23766 oder Glycyrrhizin blockiert werden konnte. Zusammenfassend konnte somit ein Einfluss von IR auf die Expression verschiedener Zelladhäsionsmoleküle in vitro und auf die Extravasation zirkulierender Tumorzellen in vivo festgestellt werden. Diese pro-metastatischen Strahleneffekte konnten durch pharmakologische Hemmung Rho-regulierter Signalwege abgeschwächt werden.

Optimization of RNA-based transgene expression by targeting Protein Kinase R

The aim of this thesis was to establish a method for repeated transfection of in vitro transcribed RNA (IVT-RNA) leading to a sustained protein expression lasting for days or even weeks. Once transfected cells recognize IVT-RNA as "non-self" and initiate defense pathways leading to an upregulated interferon (IFN) response and stalled translation. In this work Protein Kinase R (PKR) was identified as the main effector molecule mediating this cellular response. We assessed four strategies to inhibit PKR and the IFN response: A small molecule PKR inhibitor enhanced protein expression and hampered the induction of IFN-transcripts, but had to be excluded due to cytotoxicity. A siRNA mediated PKR knockdown and the overexpression of a kinase inactive PKR mutant elevated the protein expression, but the down-regulation of the IFN response was insufficient. The co-transfer of the viral inhibitors of PKR and the IFN response was most successful. The use of E3, K3 and B18R co-transfection enabled repeated IVT-RNA-based transfection of human fibroblasts. Thus, the developed protocol allows a continuous IVT-RNA encoded protein expression of proteins, which could be the basis for the generation of induced pluripotent stem cells (iPS) for several therapeutic applications in regenerative medicine or drug research.